孙宗玖，李培英，景艳杰，阿不来提**
（新疆农业大学草业与环境科学学院，乌鲁木齐 830052）
摘要：用盆栽法研究了4 份狗牙根材料对零下低温胁迫的生理响应。结果表明：随着温度的降低，狗牙根根茎电导率呈上升趋势，脯氨酸表现为先下降后上升趋势，丙二醛含量、SOD活性、POD 活性均呈先下降后上升再下降趋势，且SOD、POD 活性同步性较好。与寒敏感材料Cd128、Cd147 相比，抗寒性强的狗牙根材料Cd039、Cd093 的电导率升高较慢，丙二醛相对较低，脯氨酸上升较快，SOD 活性相对较高，POD 活性表现不稳定。
关键词：狗牙根；冻害胁迫；酶保护系统；脯氨酸
0 前言
狗牙根[Cynodon dactylon(L.)Pers.]是暖季型草坪草中综合得分最高，应用面积最大的草坪草种之一，广泛用于全球温暖地区公共绿地、运动场草坪、高尔夫球场、护坡草坪的建植。但由于其对低温敏感和抗寒能力差，在我国推广应用中狗牙根常常表现为南方地区绿色期较短,过渡带地区容易受到低温危害而出现大面积死亡,北方地区则不能安全越冬等问题[1-3]，极大地限制了其在我国较寒冷地区的推广应用。因此选育抗寒性强狗牙根材料，探讨其对低温的生理响应，已成为狗牙根抗寒性研究的重要内容之一[4,5]。
从 20 世纪70 年代以来，国内外研究学者就致力于狗牙根抗寒性的研究，主要集中在抗寒性强弱的鉴定[1,5]，低温胁迫下细胞结构和功能[6]，形态结构[7-9]，生理生化指标的响应[2-3，10-13]，如渗透调节物质、酶类保护系统、光合作用，及抗寒基因表达[14]和外施物(如脱落酸等)对其抗寒性的影响[15]等方面，且研究相对较多。但由于抗寒性为数量性状，受微效多基因控制，狗牙根对低温胁迫的生理响应机制仍未达成共识，不同抗寒的狗牙根材料对低温响应有何差异，目前仍还不清晰。虽然ZHANG[14]等进一步对新育成的抗寒品种Riviera 和寒敏感狗牙根PrinCess-77 在生理、蛋白方面变化异同进行探讨，但其所用抗寒品种仅能在过渡带表现出优良的抗寒能力。
相对而言，我国新疆狗牙根资源则表现出较强的抗寒能力[16]。如孙宗玖[2]等在新疆乌鲁木齐进行除雪试验（-26.5℃），发现新农1 号狗牙根越冬率95%以上，而生产上常用品种岸杂一号、海岸狗牙根、矮生天堂草等，均不能越冬而死亡；郑玉红[1]等对采自全国的49 份狗牙根材料进行半致死温度测定，发现来自新疆的4 份材料半致死温度都在-18℃以下，属于耐寒性材料，因此新疆狗牙根资源具有较独特的抗寒优势，有非常重要的研究价值，为探讨狗牙根抗寒生理生化机制奠定了较好的物质基础。虽然孙宗玖[2]等对低温胁迫下新疆狗牙根抗寒性生理响应进行了一定的研究，但所用材料仅为培育的狗牙根新品种，且低温处理的时间相对较短（2h），未涉及到新疆强抗寒性狗牙根材料。本文在景艳杰[5]研究基础上，结合其在新疆的越冬情况，以筛选出强抗寒性狗牙根材料（Cd039、Cd093）和寒敏感狗牙根材料（Cd128、Cd147）为对象，通过对不同冻害胁迫下各材料的电导率、SOD 活性、POD 活性、脯氨酸和丙二醛含量的监测，探讨新疆狗牙根的抗寒响应机制，为今后选育抗寒性狗牙根新品种的选育提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验地位于新疆乌鲁木齐市新疆农业大学试验场，海拔850 m，年均温6.5 ℃，年极端最高38.8 ℃，极端最低温-41.5 ℃。冬季有积雪，年降雨量230 mm，年蒸发量2570 mm，土壤结冻期11 月中旬，解冻期3 月中旬，无霜期150 d 左右。试验前该地多年种植玉米，土壤为荒漠灰钙土，肥力中等，有灌溉条件。
1.2 试验材料
参试的狗牙根材料4 份，包括Cd039（采自新疆霍城县），Cd093（来自新疆农业大学单株选育），Cd128（引自华南农业大学选育的新品系），Cd147（引自甘肃农业大学，普通狗牙根），且据景艳杰报道[5]，Cd039、Cd093、Cd128、Cd147 的叶片半致死温度分别为-19.68℃、-17.33℃、-10.20℃、-13.08℃，可分别代表强抗寒材料（Cd039、Cd093）和寒敏感材料（Cd128、Cd147）两个类型。并于2008 年5 月将供试的4 份狗牙根材料种植于新疆农业大学试验场内，小区面积1.0 m×2.5 m，小区间距70 Cm，期间进行正常的灌溉、杂草防除等田间管理工作，田间盖度均在95%以上。
1.3 试验设计及测定方法
2009 年9 月，在新疆农业大学试验场内挖取处于同一生育期且长势均一的供试狗牙根材料各5 份，移栽至花盆（口径150mm，深200mm）内，温室（温度21℃±3，相对湿度40%左右）内恢复生长10 周，然后进行低温（5~10℃的室温环境）锻炼2 周后，在低温冰柜内进行人工冻害处理。低温胁迫时，以1 ℃/h 依次下降到0 ℃、-10 ℃、-15 ℃、-20 ℃、-25 ℃，每个温度处理时间均为24 h，取出后在4 ℃下缓慢解冻，获取各供试材料的根茎，进行细胞电导率（电导法[17]）、丙二醛（硫代巴比妥酸法[17]）SOD 活性（氮蓝四唑（NBT）法[17]，SOD 活性单位以抑制NBT 光化学还原50%作为一个酶活性单位（u））、POD 活性（愈创木酚法[17]）及脯氨酸（磺基水杨酸提取法[17]）的测定，其中脯氨酸、丙二醛、SOD活性、POD 活性测定所用根茎是用蒸馏水冲洗干净后用滤纸吸干表面水分，剪碎，铝箔纸包好，放入液氮罐中速冻后，放入-26 ℃低温冰箱进行保存，而用于细胞电导率测定的根茎则在解冻后立即进行。
1.4 数据处理
利用Microsoft Excel 2003 和SPSS11.5 统计软件进行相关统计与分析。
2 结果与分析
2.1 电导率
图 1 可知随着温度的下降，4 份狗牙根的电导率均呈现增加趋势，且0 ~ -10℃区间内寒敏感狗牙根材料Cd128、Cd147 的电导率高于强抗寒狗牙根材料Cd039、Cd093，而当温度降低到-15℃以后时，4 份狗牙根材料间电导率变化较小，均已超过77%，说明供试狗牙根材料细胞膜均已受到严重的伤害。方差分析表明（图1），0℃、-10℃时强抗寒材料Cd039、Cd093 的细胞电导率明显低于寒敏感材料Cd128、Cd147（P<0.05），而当温度降低到-15℃以后时，除-20℃外，4 份狗牙根材料细胞电导率间均无显著差异（P>0.05）。说明与寒敏感狗牙根相比，强抗寒狗牙根材料仅能在0 ~ -10℃范围内表现出一定的抗寒能力和对低温的适应能力，而当低温降到-15℃以后时，这种对低温的抵抗能力已经基本丧失，进而说明植物对低温的适应性具有一定的适应范围。
2.2 丙二醛
图2 看出，随着低温胁迫的加剧，4 份狗牙根材料体内丙二醛含量呈现“先下降后上升再下降”的趋势。方差分析（图2）表明，0 ~ -15℃区间内强抗寒狗牙根材料Cd039、Cd093与寒敏感狗牙根材料Cd128、Cd147 间丙二醛含量差异不显著（P>0.05），当温度降低到-20℃以后时，材料Cd039 根茎中丙二醛含量却明显高于材料Cd128（P<0.05），而其他2 份狗牙根材料则表现出一定的不稳定性。
2.3 SOD 活性
图 3 可知，随着温度的下降，4 份狗牙根体内的SOD 活性均呈“先下降后上升再下降”的趋势，且强抗寒狗牙根材料Cd039、Cd093 体内SOD 活性高于寒敏感狗牙根材料Cd128、Cd147。方差分析（图3）表明，除-10℃外，其他各温度下4 份狗牙根材料间SOD 活性均存在显著差异（P<0.05），且强抗寒材料与寒敏感材料间SOD 活性对低温的适应存在一定的差异与不同步性。对于寒敏感材料Cd147 而言，0~ -10℃区间内其体内SOD 活性与强抗寒材料Cd039、Cd093 间差异不显著（P>0.05）；-15 ~ -20℃时，其体内SOD 活性明显低于Cd039、Cd093（P<0.05）；-25℃时，其SOD 活性与Cd093 间无显著差异（P>0.05），但仍明显低于Cd039（P<0.05）。对于寒敏感材料Cd128 而言，除0℃与Cd093，-20℃与Cd039、Cd093，-25℃与Cd039 SOD 活性表现出显著差异（P<0.05）外，其余温度下与强抗寒材料间SOD 活性差异均不显著（P>0.05）。
2.4 POD 活性
图4 可知，随着温度的降低，4 份狗牙根材料体内POD 活性的变化规律并不一致，材料Cd039 表现为“先下降后上升再下降”趋势，材料Cd093 表现为“先上升后下降在上升”趋势，而材料Cd128、Cd147 则表现为“先下降后上升”趋势，且强抗寒材料Cd039、Cd093POD 活性基本高于寒敏感材料Cd147。方差分析（图4）表明，对于材料Cd128、Cd147 而言，0℃时其体内POD 活性与强抗寒材料Cd039、Cd093 间差异不显著（P>0.05）；-10℃时其体内POD 活性与强抗寒材料Cd039 间差异不显著（P>0.05），但显著低于材料Cd093（P<0.05）；当温度降低到-15℃以后，强抗寒材料与寒敏感材料开始出现差异，材料Cd147体内SOD 活性在-15℃、-20℃时明显低于强抗寒材料Cd039、Cd093（P<0.05），而SOD活性在材料Cd128 与Cd039、Cd093 间则差异不显著（P>0.05）；-25℃时材料Cd147 体内POD 活性与强抗寒材料Cd039 间差异不显著（P>0.05），但显著低于材料Cd093（P<0.05），而材料Cd128 体内POD 活性与强抗寒材料Cd093 间差异不显著（P>0.05），但显著高于材料Cd039（P<0.05）。
2.5 脯氨酸
图 5 可知，随着温度的下降，寒敏感狗牙根材料Cd128、Cd147 体内脯氨酸含量呈一定的波动性，且一直维持较低的水平，而强抗寒材料Cd039、Cd093 体内脯氨酸含量则表现为“先下降后上升再下降”的趋势，且一直高于寒敏感狗牙根材料。方差分析表明（图5），低温胁迫下脯氨酸含量在强抗寒狗牙根与寒敏感狗牙根材料间差异显著（P<0.05），且0 ~ -25℃区间内强抗寒材料Cd093 显著高于寒敏感材料Cd128、Cd147（P<0.05），而材料Cd039脯氨酸含量则在0℃、-25℃时显著高于寒敏感材料Cd128、Cd147 （P<0.05），在-10 ~ -25℃区间则差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
细胞膜是植物遭受低温伤害和抵抗伤害的关健组织，而电导率的大小直接反映了细胞膜受低温伤害程度[18]。大量研究表明[1,2,5,19]，低温胁迫下植物细胞质膜透性增加越多，细胞受损越严重，植物的抗寒性就越差。本研究结果表明，强抗寒材料Cd039、Cd093 的细胞电导率明显低于寒敏感材料Cd128、Cd147（P<0.05），显示出强抗寒材料对低温的适应能力，但仅局限于一定的温度范围内（0 ~ -10℃）。从对低温的响应规律看，随着温度下降，4 份狗牙根材料电导率均呈现上升趋势，且初期上升急剧，后期上升较缓慢，这与魏臻武[20]等、王溶楷[21]等、孙宗玖[2]等的研究结果“随着温度降低，草坪草体内电导率出现升高趋势，且呈“S”曲线增加”存在一定的差异，可能是由于试验低温处理持续的时间长短及寒害处理中试验材料所处状态（器官离体与否，植物离土与否）相关。逆境条件下，SOD 及POD 是细胞抵御活性氧化伤害的重要保护酶，在清除O2-，H2O2和过氧化物，阻止或减少羟基自由基形成，保持膜系统免受损害等方面起重要作用[22-23]。大量研究表明[2,24-26]，SOD 活性、POD 活性及其持续时间与狗牙根抗寒性具有一定的相关性，且不同植物中两种酶类对低温的响应并不一致，均存在一定的争议。如在SOD 活性对低温适应上，一种观点认为随着温度降低，SOD 活性逐步降低，而另一种观点则认为在临界温度之上时，SOD 活性逐步升高，达到临界温度时则迅速下降[24]，也有人认为，SOD 活性随低温胁迫的增加出现递减地降低[21]。
本研究结果表明低温胁迫过程中狗牙根体内SOD 活性基本表现为先下降后上升再下降的趋势，而POD 活性则基本表现为先下降后上升的趋势，可能是因为狗牙根在进入零下温度需要一个适应阶段导致SOD、POD 未能做出积极的响应，初期表现出下降趋势，随后逐步适应低温，SOD、POD 活性出现增加，当温度降低到一定程度后，酶活性开始逐渐丧失，但两种酶类活性持续增加时间的长短及活性的高低存在一定的差异。从两类酶类与抗寒性关系看，低温胁迫过程中，强抗寒材料Cd039、Cd093 的SOD活性高于寒敏感材料Cd128、Cd147，而在POD 活性上则强抗寒材料与寒敏感材料间变动较大，无一定规律。脯氨酸的累积与植物抗寒性的关系方面，目前存在两种观点:一种观点认为脯氨酸的累积与抗寒性之间存在着一定的相关性[27]，另一种观点与此相反，认为脯氨酸的累积与抗寒性无关[28,29]。
本研究结果表明，低温胁迫过程中，强抗寒材料Cd039、Cd093 的脯氨酸含量基本高于寒敏感材料Cd128、Cd147，且脯氨酸随着温度的降低呈先下降后上升趋势，出现这种趋势可能是由于狗牙根感受低温需要一定时间而不能做出迅速反应所致。丙二醛含量的多少反映了细胞受低温的伤害的程度。李荣富[26]等认为随着温度的降低，杏花丙二醛含量呈现上升趋势。本研究表明，随着温度的下降，狗牙根体内丙二醛含量呈现先下降后上升再下降的趋势，同时结合SOD、POD 活性及脯氨酸结果，初步认为可能与低温胁迫下其他非酶保护系统或其他酶保护系统的活性相关，需要得到进一步研究。
4 结论
人工冻害胁迫下，随着温度的降低，狗牙根根茎电导率呈上升趋势，脯氨酸表现为先下降后上升趋势，丙二醛含量、SOD 活性、POD 活性均呈先下降后上升再下降趋势，且SOD、POD 活性同步性较好。与寒敏感材料相比，抗寒性强的狗牙根材料电导率升高较慢，丙二
醛相对较低，脯氨酸上升较快，丙二醛相对较低，脯氨酸上升较快，SOD 活性相对较高，POD 活性表现不稳定。
参考文献：略
基金项目：教育部博士点基金项目（200807580004）、国家自然基金项目（30760154）、新疆自然科学基
金项目（2009211A04）及科技部国家科技支撑项目（2006BAD01A19-2）
作者简介：孙宗玖（1975-），男，汉，内蒙古敖汉人，副教授，博士，主要从事草地培育与草坪学教学与
科研工作
通信联系人：阿不来提(1952- )，维吾尔族，教授，主要从事草坪方向的研究工作. E-mail: xndablt@163.com
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